UPB-CTTIP Romdoc: Record#1489: Caracterizarea unor sisteme enzimatice redox şi aplicaţii bioelectroanalitice

Thesis /

ROMDOC-THESIS-2017-972

Caracterizarea unor sisteme enzimatice redox şi aplicaţii bioelectroanalitice

Diaconu, Mirela
2012-07-15

Abstract: CARACTERIZAREA UNOR SISTEME ENZIMATICE REDOX SI APLICATII BIOELECTROANALITICE Lucrarea a avut ca obiectiv principal realizarea si caraterizarea a 3 sisteme analitice de tip senzor amperometric pe baza de enzime redox - lacaza si tirozina si un sistem analitic pe baza de nanoparticule de siliciu biofunctionalizate. Sistemele analitice dezvoltate au fost utilizate atat in evaluarea proceselor cu transfer de sarcina in care sunt implicate cele doua enzime, cat si in determinarea cantitativa a unor compusi de tip fenolic. In prima etapă de studiu (capitolul IV) s-a realizat un sistem analitic de tip biosenzor amperometric, pe bază de lacază imobilizată intr-o matrice nanocompozită de chitosan şi nanotuburi de carbon. Sensibilitatea biosenzorului Lacc-CS-MWCNT/Au (846A/mmol pentru acid rosmarinic) a fost cu trei pană la cinci ordine de mărime mai mare faţă de sensibilitatea raportată in literatura de specialitate pentru biosenzori pentru compuşii studiati datorită inglobării in stratul modificant (filmul de chitosan) a nanotuburilor de carbon ce măresc suprafaţa electroactivă şi imbunataţesc conductivitatea. Biosenzorul realizat prezintă un răspuns liniar pe domenii relativ largi de concentraţie, pentru acidul rosmarinic şi acidul cafeic, limitele de detecţie fiind de 1.51x10-7 mol L-1 pentru acidul cafeic, respectiv 2.33x10-7 mol L-1 pentru acidul rosmarinic precum şi o bună reproductibilitate a rezultatelor măsurătorilor. Biosenzorul realizat a fost aplicat in evaluarea conţinutului total de polifenoli din extracte de Salvia Officinalis si Menthea piperita, plante cultivate “in vitro”, normalizate la acid rosmarinic. In etapa a doua (capitolul V) s-a realizat un sistem bienzimatic pe bază de lacază şi tirozinază inglobate in matrice nanocompozită de CS-MWCNT, Lacc-Tyr-CS-MWCNT/ITO. Strategia de bioamplificare a semnalului analitic prin utilizarea sistemului bienzimatic lacaza-tirozinaza a condus la o crestere a sensibilitătii biosenzorului bienzimatic (de 10.68 ori mai mare decat cea obţinută in cazul celui monoenzimatic utilizand acidul rosmarinic ca substrat). Calibrarea biosenzorului bienzimatic in prezenţa surfactantului nonionic, Tween 20, utilizat pentru evitarea fenomenului de pasivare a suprafeţei biosenzorului a condus la o extindere a domeniului de liniaritate pană la o concentraţie de 10-5 molL-1 pentru toţi compusii studiaţi, precum si la o imbunătăţire semnificativă a limitei de detecţie (4.20x10-8 mol L-1 pentru acidul rosmarinic comparativ cu 2.50x10-7 mol L-1, valoare obţinută in cazul calibrării in absenţa surfactantului, 4.04 x10-7 mol L-1 pentru acidul galic faţă de 1.55x10-6 mol L-1). Stabilitatea operaţională a fost semnificativ imbunatăţită in prezenţa surfactantului non-ionic, o scadere cu 10% a valorii curentului inregistrat obţinandu-se după 25 măsurători succesive. Singurul dezavantaj a fost acela de scădere a sensibilităţii răspunsului biosenzorului bienzimatic in mediu de surfactant, valoarea atinsă de sensibilitatea biosenzorului faţă de acidul rosmarinic reprezentand 80% din valoarea iniţială a sensibilităţii in mediul de tampon Mc Ilvaine fără surfactant, iar pentru acidul galic atingand numai 70% din valoarea iniţială. Biosenzorul bienzimatic realizat a fost utilizat pentru evaluarea conţinutului de polifenoli din probe reale, extracte din Salvia Officinalis si basilicum, iar rezultatele au fost comparate cu cele obţinute utilizand o metodă cromatografică LC-DAD-ESI MS. Sistemul pe bază de straturi tiolice depuse pe un suport electrodic de ITO modificat cu nanoparticule de aur realizat si prezentat in capitolul VI a fost utilizat mai departe in studiul proceselor cu transfer de electroni in care este implicată lacaza, enzima redox, in mediu eterogen. Imaginile de microscopie de forţă atomică inregistrate pentru filmul de aur depus au evidenţiat o structură relativ omogenă, centrii de nucleere la suprafaţa cărora se formează agregatele de nanoparticule de aur fiind dispusi uniform pe suprafaţa electrodului de ITO. Agregatele formate au dimensiuni de 200-500 nm. Rugozitatea medie a filmului depus a fost de 9.8 nm. Depunerea filmului de nanoparticule de aur pe suportul electrodic de ITO a condus la o crestere semnificativă (1.75 ori) a valorii corespunzatoare intensităţii curentului de reducere a Fe3+/Fe2+, ca urmare a cresterii conductivităţii si a suprafeţei electroactive, precum si la o scădere a valorii Ep. Valoarea rezistenţei la tansferul de sarcină Rct a scazut de la 4.23 kΩ la 1.14 kΩ. Filmul de aur depus pe suprafaţa electrodului de ITO a condus la o accelerare a reacţiei redox corespunzătoare cuplului Fe(CN)6 3-/4-, imbunătăţind conductivitatea si facilitand transferul de sarcină la suprafaţa electrodului. Electrodul enzimatic realizat prin imobilizarea lacazei la suprafaţa straturilor autoasamblate a putut fi utilizat ca model pentru studiul proceselor cu transfer de sarcină in care sunt implicate enzimele redox de tipul lacazei. Reducerea bioelectrocatalitică a oxigenului la suprafaţa electrodului dezvoltat, atat in prezenţa cat si in absenţa mediatorului ABTS a confirmat menţinerea proprietaţilor biocatalitice ale lacazei imobilizate. Ultimul capitol al tezei (capitolul VII) a avut drept obiectiv realizarea unui sistem analitic pe bază de nanoparticule de siliciu biofuncţionalizate cu film de chitosan utilizat pentru imobilizarea unor enzime redox. A fost dezvoltata o nouă metodă de biofuncţionalizare a nanoparticulelor de siliciu, utilizand un silan ce conţine o grupare de tip aldehidic ce a redus semnificativ timpul necesar atasării filmului de chitosan la suprafaţa nanoparticulelor de siliciu. Analiza spectrelor FTIR inregistrate pentru nanoparticulele de siliciu biofuncţionalizate cu chitosan a demostrat prezenţa la suprafaţa acestora a grupărilor funcţionale de tip -NH2 si –OH diponibile pentru imobilizarea ulterioară a unor enzime redox de tipul lacazei tirozinazei. Cuvinte cheie: enzime redox, lacaza, tirozinaza, transfer eterogen de electroni, biosenzori, polifenoli. Characterization of enzymatic redox systems. Bioelectroanalytical applications The aim of this thesis was to develop different analytical systems based on redox enzymes immobilized on amperometric sensors and biofunctionalised silicon nanoparticles. The analytical systems were used for the evaluation of the heterogeneous electron transfer mechanisms between redox enzymes (laccase and tyrosinase) and different electrode materials with applications in biosensors and biofuell cells. Laccase was employed as a biorecognition element in order to develop a biosensor for evaluation of total phenolic content from two in vitro cultivated plants: Salvia Officinalis and Mentha piperita. The enzyme was immobilized by entrapment into a chitosan (CS) - multiwall carbon nanotubes (MWCNT) nanocomposite layer obtained by electrodeposition. Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) in reflectance it was demonstrated that the laccase entrapped into the CS-MWCNT nanocomposite preserved its secondary structure. Optimum conditions for CS-MWCNT nanocomposite layer deposition (2 mg MWCNT/ml chitosan solution 0.5% prepared in 1% acetic acid) on gold support using a controlled potential of -1.5 V vs Ag/AgCl for 5 minutes were established taking into consideration the layer capacity value. Calibration of the developed biosensor was performed on four phenolic acids (caffeic acid, rosmarinic acid, chlorogenic acid and gallic acid). Due to the proper enzyme environment and improved conductivity the biosensor displayed analytical characteristics of fast response, good detection limits (2.33×10−7 molL−1 for rosmarinic acid), three to five times higher sensitivity (846 A/mmol for rosmarinic acid) on the micromolar concentration range with respect to sensitivity for other biosensor for polyphenols determination. The second developed system was based on laccase and tyrosinase, redox enzymes co-entrapped into the CS-MWCNT nanocomposites matrix. A highly competitive detection limit (4.2×10−8 molL−1 for rosmarinic acid) and sensitivity (148 μA mmol−1 and respectively 119 μA mmol−1 in nonionic surfactant medium) have been achieved through dual signal amplification offered by synergistic effect of MWCNT and bioamplification by using laccase-tyrosinase bienzymatic system. The use of surface active additive, Tween 20, considerably improved the detection limit and operational stability of the biosensor while linear detection range was extended up to 10-5 molL-1 for all tested substrates. The developed biosensor was applied to evaluate the TPC from real samples (extracts of Salvia officinalis and cultures of Basilicum callus). The obtained results, expressed in rosmarinic acid equivalents were compared to those obtained by LCDAD ESI MS method. The third analytical system was developed in order to study the heterogeneous electron transfer process of laccase from Trametes versicolor on indium doped tin oxide (ITO) electrodes functionalized with gold nanoparticles(GNP). The assembly of GNP film on ITO support was performed through generation of H+ ion at the electrode surface during hydroquinone electrooxidation at 1.2 V vs Ag/AgCl. AFM micrograph of gold nanoparticles assembly showed a uniform distribution of nucleation centers on electrode surfaces. Size of gold aggregates was in the range of 200-500 nm. Electrochemical characterization of GNP functionalized ITO electrode was carried out by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, results proving that gold nanoparticles enhanced the conductivity, facilitating the charge transfer at the modified electrode surface. Two different thiols monolayers self assembled on GNP-ITO electrode were investigated and cysteamine (Cys) monolayer was found to be optimum for heterogeneous electron transfer. Electrocatalytic behavior of laccase immobilized on Cys- GNP-ITO electrode toward oxygen reduction reaction was evaluated using cyclic voltammetry in the presence of 2,2′-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfuric acid (ABTS). The sigmoidal-shaped voltammograms was registered for ABTS reduction in oxygen saturated buffer solution is characteristic for a catalytic process. Electrocatalytic reduction of oxygen at laccase modified electrode was studied also in absence ABTS mediator. The registered voltamogramm clearly showed a significant increase of faradaic current which is the evidence of the interfacial oxygen reduction. The last developed system is based on biopolymer functionalized silicon nanoparticles. The biofunctionalization procedure consists of two steps and it was developed in order to bind efficiently and effectively chitosan biopolymer to the silicon nanoparticles surface. Using triethoxsilylbutyraldehyde, a silane compound possessing terminal carboxyl functional group instead of other known silanes, has reduced the time required to attach the desired coating. FT-IR analysis performed on chitosan coated SiNP samples has proved the presence of –NH2 and –OH functional groups on their surface, available for further attachment of redox enzymes. The attached chitosan biopolymer film has maintained its native structure, therefore preserving its biocompatibility properties. Keywords: redox enzymes, laccase, tyrosinase, heterogeneous electron transfer mechanism, biosensors, polyphenols

Keyword(s): Biosenzori -- Teză de doctorat ; enzimologie -- Teză de doctorat ; Electrochimie -- Teză de doctorat
OPAC: See record in BC-UPB Web OPAC
Full Text: see files

Record created 2017-02-16, last modified 2017-02-16

Rate this document:

Be the first to review this document.

Discuss this document:

Start a discussion about any aspect of this document.